DNA 转染技巧 细胞

不要使用刚解冻的细胞。解冻后和转染前，至少传代细胞 3 次，以便它们有时间恢复并恢复正常行为。在细胞处于对数生长期和达到汇合之前传代细胞。当天将细胞铺板转染前，以便在转染当天达到 60-80% 的视觉汇合。细胞应该健康且分裂活跃，培养时间不应过长（> 8 周）。可使用 OZ Biosciences 的 WST-8 细胞增殖试剂盒或 MTT 试剂盒 (#MT01000) 评估细胞活力，并可使用 OZ Biosciences 的衰老试剂盒 (#GXS003) 检查衰老。细胞和培养基必须无污染（支原体、酵母, 细菌）。细胞应保持在最佳培养条件下。

DNA 质量

DNA 溶液必须在不含 DNase/RNase 的水或 TE 缓冲液中制备。DNA 必须尽可能纯净，不含污染物（蛋白质、脂质、碳水化合物）和内毒素。DNA 溶液的 260/280nm 的 Abs 应在 1.7 和 1.9 之间。请勿使用用于转染的较低或较高比例的 DNA 溶液。确保您的启动子与待转染的细胞相容。

转染试剂的比例

测试多种试剂：DNA 的比例非常重要，以便找到以最少的成本实现最高转染效率的正确比例毒性。通过使用固定量的 DNA (µg) 和改变转染试剂的体积来优化试剂/DNA 比率。例如，将 Helix-IN 转染试剂的浓度从 1–2.5 μl 变化每 1 μg DNA 找到最佳比例。

DNA 量

重要的是要参考您当前使用的试剂的具体方案，并记住并非所有细胞都需要相同数量的 DNA。按照说明手册/相关方案中的建议使用不同数量的 DNA优化的转染试剂：DNA 比率。您可以根据转染的细胞系和转染试剂调整DNA的量。调整DNA剂量时一定要保持DNA：试剂比例恒定。

Controls

强烈建议您在转染中使用阳性对照实验。 OZ Biosciences 提供范围广泛的 pVectOZ 控制质粒，编码最常见的报告基因（GFP、b-Gal、荧光素酶、SEAP、CAT）。Mock 转染：在没有任何 DNA 的情况下进行转染对照，以便可以观察到转染试剂引起的最终非特异性效应。

转染实践

我们建议在 DMEM 或 PBS 中制备 DNA/试剂复合物，无需任何补充。让试剂达到室温在开始实验之前。将 DNA 添加到转染试剂后，在室温下孵育 20 分钟以形成最佳复合物，然后将混合物直接添加到细胞中。 DNA/试剂复合物形成后不要等待超过 30 分钟。使用 Helix-IN 时不要孵育复合物 Helix-IN/DNA lRT 少于 30 分钟 将复合物逐滴分配到细胞上并轻轻摇动板以确保均匀分散。 N/P 电荷比

许多研究报告正阳离子脂质和负 DNA 之间的电荷比对于生成脂质复合物以成功进行质粒递送的重要性。这些评估得出结论，电荷比对脂质复合物的物理化学特征以及随后的转染效率有相当大的影响。通常，增加电荷比会改善阳离子脂质与 DNA 之间的静电相互作用。然而，已经发现在最佳电荷比之上，细胞毒性发生剂量依赖性增加。该电荷比以 N/P 比已知，根据阳离子脂质中的氨基 (N) 和 DNA 主链的磷酸基团 (P) 的正电荷（或氨基酸的负电荷）计算蛋白质）浓度。在此，DOTAP 有一个氮进位g 一个正电荷。作为直接结果，1 nmol 的 DOTAP 会产生 1 nmol 的正电荷。另一方面，1 µg DNA 会产生 3.1 nmol 带负电荷的磷酸盐。 [1] Mohammed-Saeid, W., 等人。二肽修饰的双子表面活性剂作为基因传递载体：探索烷基尾在其理化行为和生物活性中的作用。 AAPS 期刊，2016 年，18 日，1168-1181。 [2] Datta, D., 等人。电荷比对 Lipoplexes 体内免疫原性的影响。 Pharmaceutical Research, 2017, 34, 1796-1804.

siRNA 转染技巧 细胞

不要使用刚解冻的细胞。解冻后转染前，将细胞至少传代 3 次，以便它们有时间恢复并恢复正常行为。在细胞处于对数生长期和达到汇合度。在转染前一天铺板您的细胞，以便在转染当天达到 60-80% 的视觉汇合度。细胞应该是健康的并且分裂活跃，它们不应在培养物中放置太久（> 8 周）。可以使用 OZ Biosciences 的 MTT 试剂盒 (#MT01000) 评估细胞活力，并可以使用 OZ Biosciences 的衰老试剂盒 (#GXS003) 检查衰老。细胞和培养基必须没有污染（支原体、酵母、细菌）。细胞应该是保持最佳培养条件。

siRNA

使用不含 RNase 的材料。使用高质量的 siRNA（PAGE 纯化和脱盐）。如果可能，使用低 siRNA 浓度 (1-10nM) 以避免脱靶和/或细胞毒性作用。请勿用水稀释您的 siRNA 储备液，更喜欢制造商的缓冲液或 100mM NaCl 的 50mM Tris (pH 7.5) 以避免变性。Calcu延迟正确数量的 siRNA：平均 siRNA 分子的分子量约为13.500.

控件阳性对照：使用针对管家基因（即 GAPDH）的 siRNA 或标记的 siRNA。阴性对照：使用错配和/或非靶向序列作为阴性对照。 转染实践

我们建议在不添加任何添加剂的情况下在 DMEM 或 PBS 中制备 siRNA/试剂复合物。让试剂达到室温。将 siRNA 添加到转染试剂后，在室温下孵育 20 分钟以获得最佳复合物形成并直接将错误添加到您的细胞中。一旦形成复合物，不要等待超过 30 分钟。将复合物分散到细胞中以正确的方式轻轻摇动板以确保均匀分散。siRNA 转染后的最佳沉默可在 mRNA 表达测定 24 小时后获得，蛋白质表达测定可长达 72 小时。

Lipofection 和 Polyfection 之间的主要区别是什么？ Lipofection 和 polyfection（分别基于脂质和基于聚合物的转染）是两种使用合成载体将核酸递送到细胞中的转染方法。

即使这两种技术的最终结果相同，但仍存在一些差异，将核酸递送应用定向到一种或另一种（参见下表）。这两种技术之间的主要区别在于\"轻松”修改、接枝、支化或改变胺的量或聚合物的疏水性的能力；这导致高度浓缩和压缩 DNA，以便更有效地输送到核。 Lipofection 的主要优势在于它的多功能性：与 Polyfection 不同，Polyfection 可以将所有核酸甚至蛋白质输送到细胞中，后者优先用于 DNA 应用。转染方法的选择将取决于细胞类型和应用。如果研究脂质信号转导时不建议使用 polyfection 转染悬浮细胞系，则不太推荐使用基于脂质的试剂。这两种技术都与稳定的细胞系生成兼容，在处理原代细胞时应谨慎使用：在这种情况下，必须高度考虑磁转染。

LIPOFECTIONPOLYFECTION

结构、特性、机制递送

脂质体、胶束、反胶束（两亲性）——疏水融合/去稳定化/触发器细胞质释放可单独使用或在存在共脂质的情况下使用一般基于相同模型：亲水头基、疏水锚和连接基线性、分支或球形水可溶性、高电荷密度质子-海绵效应核摄取可能多种设计、接枝成分、长度、MW...

优势

多功能：任何核酸可生物降解与细胞膜具有出色的生物相容性无包装尺寸限制形成复合物所需的时间短形成复合物时具有出色的生物利用度高DNA 浓缩/递送可生物降解低细胞压力高结构完整性和存储稳定性低毒性（低至中等 MW 聚合物）隐形转染随着时间的推移增加聚合复合物的稳定性无自发荧光

弱点

自发荧光低结构完整性可干扰脂质信号在体循环中快速体内清除轻度炎症体内反应不适用于所有细胞（原代）需要胶体不适用于所有核酸不适用于悬浮细胞高分子量聚合物显示出毒性。不适用于所有细胞（原代）。

磁转染一般性 入门套件是否包含客户进行实验所需的所有材料？

所有起始试剂盒均包含基于磁转染实验的必要材料。我们以 KC30200 起始试剂盒为例。该试剂盒包含：超磁板 (MF10000) + 100µL 每个 PolyMag (PN30100 ), CombiMag (CM20100) + PolyMag Neo (PG60100)。根据试剂盒的不同，样品和体积可能会有所不同。

我可以将 SUPER MAGNETIC PLATE (ref# MF10000) 用于孔、培养皿和烧瓶吗？我应该什么时候使用 MF10096 或 Mega 磁板磁力板MF14000?

超强磁力板MF10000适用于从384孔板到6孔板的任何培养板。其标准格式适用于任何细胞文化模式来自一个 35 毫米的盘子，一个 75 平方厘米的烧瓶。大小对应于一个细胞培养板（8.3cmx12.5cm），因此一次适合一个板。这是我们推荐用于测试 Magnetofection 产品并发送给客户进行试剂评估的产品。 - MF10096 专为 96 孔板设计。每个磁铁都直接位于培养板每个孔的下方，因此每个孔都有一个强磁场。 - MF14000，Mega Magnetic Plate，类似于 Super Magnetic Plate，但更大 (20.1cmx25.7cm)，因此一次最多可容纳 4 个盘子。它的表面对应4个超强磁力板（MF10000）。

转染后铁纳米颗粒在细胞内停留多长时间？

我们所有的纳米颗粒都是完全可生物降解的，它们不会干扰细胞的生物学特性：我ron 核心及其涂层由特定材料制成，允许在细胞、组织和生物体中降解和生物相容性。而在整个生物体中，氧化铁已被证明可以通过天然铁代谢途径快速降解（铁离子被纳入血红蛋白库），而铁珠在细胞中会持续更长的时间：这个时间可能从一周到三周不等取决于纳米粒子的剂量。尽管如此，除非研究途径暗示铁代谢，否则当细胞中存在铁纳米颗粒时，细胞信号传导不会受到任何干扰。重要的是要考虑纳米粒子通过内吞作用渗透到细胞中；没有任何可能损坏细胞膜的物理作用。此外，实际上，磁性纳米粒子不会干扰任何分子生物学实验。从 DNA 或 RNA 分析（PCR、qRT-PCR）到蛋白质实验（蛋白质定量、WB、免疫印迹、酶测量）所有可以执行标准程序

在一次转染中有多少纳米颗粒会进入典型的细胞类型（例如 HEK-293、NIH-3T3、人成纤维细胞）？

我们真的不知道这个数字在磁转染过程中进入细胞内部的纳米颗粒。尽管如此，我们还是可以为您提供一些可用于计算每个细胞的纳米颗粒数量的指示（理论上，但这将取决于所用试剂的体积和细胞培养形式）：纳米颗粒的数量估计约为 2.5 x 10e9每毫升最多 2 x 10e12 个颗粒。这只是一个指示，因为有关试剂浓度和配方的信息是机密的。

降解铁纳米粒子需要多长时间？

降解时间将取决于细胞模型（特别是其铁代谢）、纳米颗粒的铁含量等。我们可以估计纳米珠停留 3 或 4 天降解开始前的细胞内部。同样，这个降解时间值将取决于细胞（在 PBMC 中，磁转染后 15 天，一些细胞仍然被外部磁铁吸引）和其他因素。这里的要点是我们的纳米粒子是完全可生物降解的，即使在体内实验中也是相容的（在体内，降解将遵循铁代谢途径）。

Magnetofection 可以用于反向转染吗？

磁转染可用于反向转染。该协议与\"经典”Magnetofection 一样简单：遵循复杂地层的协议。一旦他们重新形成后，将复合物（DNA/纳米颗粒）添加到培养皿中。然后，应用磁场将它们吸引下来至少 5 到 10 分钟。最后，将培养板保持在磁性板上，并将您的细胞直接添加到含有复合物的孔中。然后，遵循标准协议，直到评估 treansgene 表达式。

将转染板长时间（24/48 小时？）留在磁铁上会有什么影响？

长期孵育将细胞培养皿放到磁板上是没有效果的。我们建议将细胞在磁板上孵育 20 分钟的原因是 10-15 分钟后达到平台（例如 NeuroMag/DNA 复合物摄取）。将细胞留在平板上的时间更长不会提高效率。

LipoMag Kit / MagnetoFectamine Magnetofectamine (Lipofectamine 2000 + CombiMag) 与 LipoMag Kit (DreamFect Gold + CombiMag) 相比如何?

这是一个难题，因为细胞与细胞之间以及细胞培养条件与细胞培养条件之间的效率差异很大。这意味着一个实验室可能更喜欢 LipoMag Kit（CombiMag + DreamFect Gold) 和另一个实验室可能更喜欢 Magnetofectamine，即使它们在相同的细胞上工作。最好是测试这两个试剂盒并进行比较；否则我们的建议将主要基于您想要转染的细胞类型。如果您不确定要测试哪一个，请随时联系我们寻求建议。

您是否有 Magnetofectamine 的替代品用于 HEK 中的慢病毒生产？

这些细胞非常容易sy 转染，因此，磁转染可能不是获得高产量慢病毒生产的唯一方法。实际上，Magnetofection 通常用于原代细胞或难以转染的细胞。这就是为什么我们会推荐我们的 DreamFect Gold 转染试剂，它非常强大，可用于 LV 生产。该试剂允许多种质粒共转染。因此，我们建议您尝试使用 DreamFect Gold (DG) 与 Magnetofectamine 并行生产 LV。

NeuroMag 我们可以在玻璃上生长的细胞上使用 NeuroMag 吗？

绝对可以；描述在神经元中使用 Magnetofection 的首批工作之一是在玻璃盖玻片上进行的。您可以参考 Buerli et al, 2007, Nature Protocols 了解更多信息（参见我们的引文数据库）。在我们的实验室中，我们通常对玻璃上生长的细胞进行 NeuroMag 转染没有任何效率损失。

我们始终使用 NeuroMag 试剂获得转染的星形胶质细胞。我该怎么办？

我们已经观察到，当 DNA 数量或 NeuroMag 比例未针对实验模型进行优化时，NeuroMag 优先转染星形胶质细胞或神经胶质细胞。我们建议尝试保持 DNA 数量不变并改变 NeuroMag 体积：例如，使用 1 µg DNA 和 1、2 或 3 µL NeuroMag。根据细胞模型、DIV、所用介质、比率必须针对每个实验室进行优化。我们的技术团队很乐意帮助您设置最佳条件。

在您的 NeuroMag 协议中，什么是\"将 NeuroMag / DNA 复合物添加到细胞上 [如果 > 10，则在培养基中生长DIV or culture medium if < 10 DIV]\" means ?

细胞培养条件应根据 DIV 改变： - 对于长期培养 (>DIV 10)，它是建议从 DIV 5 开始每 3 天更换 50% 的培养基（因此第一次更换培养基是在 DIV 8）。此外，需要更高的初始细胞密度（每 35 mm 培养皿 800,000 个细胞）。转染前 24 小时，更换50% 的培养基使用新鲜培养基。确保您的细胞培养物在转染实验前不会被激活：机械冲击、电激活、实验前一小时内的培养基更换可能会导致神经胶质细胞激活，以高水平转染神经胶质细胞而非神经元结束。

PolyMag / PolyMag Neo PolyMag 和 PolyMag Neo 有什么区别？

如果基本特征两种试剂的 ics 非常相似，它们的行为完全不同。 PolyMag Neo 是 PolyMag 的改进版本。在许多细胞模型中，PolyMag Neo 在转染细胞百分比和转基因表达水平方面比 PolyMag 更有效。这是由于与 PolyMag 相比，它具有高 DNA 压实能力。因此，由于 PolyMag Neo 效率更高，因此需要的 DNA 更少，否则如果我们使用与 PolyMag 相同数量的 DNA，可能会出现毒性；但这只是因为使用了太多的 DNA 并进入了细胞。总之，与 PolyMag 相比，PolyMag Neo 是一项真正的创新。它允许更多的 DNA 进入细胞，因此需要更少的 DNA 量。

\"无添加培养基”到底是什么意思？

无添加培养基本质上是指不含血清、抗生素、抗-真菌或抗支原体sma 治疗或非必需氨基酸。拥有谷氨酰胺不是问题；谷氨酰胺不影响转染。在我们的实验室中，我们更喜欢使用 OptiMEM 或 DMEM 甚至 Hepes 缓冲液来形成复合物，但 RPMI 也可以。

珠子由氧化铁制成。你能告诉我它们是否由 100% 氧化铁制成吗？珠子中的铁含量是多少？

磁性纳米粒子由涂有特定化合物的氧化铁制成，可使纳米粒子与核酸相互作用并形成复合物。这种化合物在细胞内释放 DNA 方面也起着重要作用。因此，我们的颗粒由氧化铁和涂层制成。总的来说，铁占纳米粒子重量的一半；另一半是涂层。确切的成分是专有和机密的。

SilenceMag 你对 100mm 板的 Silence Mag 有什么建议吗？

We recommend using 20 µL SilenceMag for 10nM siRNA (final concentration) 作为起点。然后，为了优化条件，我们建议：对于 1-5 nM siRNA，使用 15-25 µL SilenceMag；对于10 nM siRNA，使用 20-30 µL SilenceMag；对于 20 nM siRNA，使用 30-40 µL SilenceMag；对于 ≥ 50 nM siRNA，使用 40-50 µL SilenceMag。

如何提高基因沉默效率或长时间沉默基因？为了提高基因沉默效率或长时间沉默基因表达，我们通常建议每隔 24 小时或每三天进行一次连续转染。Magnetofection 的优势在于您可以进行培养基更换，同时将细胞保持在磁铁：磁性复合物被吸引到细胞表面，未结合的物质被去除。这允许降低毒性。以这种方式可以重复进行顺序转染。许多出版物已使用顺序转染来增加基因沉默。LIPOFECTIONDreamFect Gold Dreamfect Gold 能否承受多次冻融，还是我真的应该制作小等分试样并将它们储存在 -20C 下？

DreamFect Gold 绝对可以经受多次冻融循环。我们通常不建议对我们的脂质试剂进行等分，因为塑料管和脂质之间可能会发生相互作用。不过，如果您想制作一些等分试样，请仅使用聚丙烯管。

如何提高效率和降低毒性icity ?

为了提高效率和活力，需要优化转染条件。目标是找到理想的核酸量和 DreamFect Gold (DG) 体积。 (1) 保持 DG 与 DNA 的比例不变（例如，每 µg DNA 3 µL 应该没问题——即 3:1 的比例），并在 24 孔板中将 DNA 数量从每孔 0.125 到 1 µg 不等。 (2) 一旦找到 DNA 量，将比例从 1:1 变为 4:1 甚至 5:1（少量 DNA 允许使用更高的 DG 体积而不会增加毒性）。

DreamFect 如何用DreamFect和siRNA提高基因沉默效率？

有 2 个选项可以测试：(1) 在转染时尝试不同的培养条件，这取决于细胞对此的耐受能力，当然如果进行以下实验允许它：a。血清转染游离培养基：照常培养和传代细胞，并按照建议制备 siRNA 和 DreamFect (DF) 的复合物。在复合物孵育期间（RT 20 分钟），将要转染的细胞放入无血清培养基中。将复合物添加到细胞中，4 小时后将血清添加到培养基中。一些细胞在饥饿时更容易被转染。使用不同的转染条件（即改变体积）：照常培养和传代细胞。以较小的体积转染它们（例如，使用细胞培养和转染推荐体积的一半）。 4 小时后添加培养基至原始体积。这应该可以提高复合物与细胞相遇的机会。(2)- 优化 siRNA 浓度；使用 2 至 4 µL DF 尝试 25nM 至 100 nM。降低 siRNA 数量可能会改善最终结果。 siRNA 可被视为细胞的病毒攻击并触发免疫反应。因此，如果过多的 siRNA 进入细胞，结果可能与预期相反。

DreamFect Stem 可以 DreamFect Stem 也转染其他细胞或仅转染干细胞？

是的，DreamFect stem 当然可以转染其他细胞，但它针对干细胞进行了优化。

您能否概述一下 DreamFect、DreamFect Gold 和 DreamFect Stem 之间的具体区别？

DreamFect (DF) 是我们的第一代转染试剂；推荐用于细胞系。DreamFect Gold (DG)是第二代；它是 DreamFect 的改进版本。基本上，DF 和 DG 应该具有相似的转染效率（即转染的细胞数量），但 DG 会导致更高的转基因表达。DreamFect Stem 专为多能干细胞开发，因此是最佳选择针对这些细胞进行了优化（效率更高，毒性更低），而 DF 和 DG 对于细胞系更为通用。

DreamFect Stem 能否用于小鼠神经干细胞？

即使 DreamFect Stem 是真的专为任何干细胞设计，我们始终推荐用于神经干细胞的 NeuroMag 转染试剂。实际上，NeuroMag 最初是为初级海马和皮层神经元设计的，在每种\"神经细胞类型”中都显示出非常好的效率。许多论文表明它在任何来源的初级海马和皮层神经元以及小脑颗粒、运动神经元、纹状体中的效率神经元、星形胶质细胞甚至一些细胞系。此外，我们和其他人已经证明，NeuroMag 可高效转染神经干细胞而不分化它们；转染后，毒性真的很低，细胞keep 它们的功能特性。参见例如 Pickard M., Biomaterials。 2010; 32(9):2274-84 和 Sapet C.，生物技术。 2011; 50(3):187-9。这就是我们推荐 NeuroMag 用于此类细胞的原因。对于神经干细胞，应降低 DNA 数量，使用比例应为 1:1。

将质粒和DreamFect Stem的混合物加入细胞后，细胞有形成团块的倾向；还观察到毒性。

Dreamfect Stem 不应出现低效率、结块和毒性。这主要是在转染条件未优化时观察到的。实际上，可能需要同时改变 DNA 量和试剂体积：首先改变 DNA 量和固定比例的 DNA/DreamFect Stem，然后改变 DreamFect Stem 和固定量 DNA 的比例。

我需要在转染后的第二天更换培养基吗？或者我可以在接下来的几天继续使用直到评估实验吗？

转染后的第二天没有必要更换培养基，但我们注意到转染后至少 4 小时更换培养基会增加转染率细胞和细胞存活。

摇篮曲 摇篮曲管被放置在 -20ºC 而不是 4ºC。是否知道这是否会显着影响摇篮曲的活性？

摇篮曲转染试剂必须在 4°C 下储存。然而，单次停留在 -20°C 不会削弱其能力。

用 Lullaby

基因沉默 i 转染 siRNA 后 24 小时和 48 小时 Q-PCR 结果的表达没有变化s 通常在转染后 72 小时测量，但在 48 小时后使用摇篮曲时应观察。为了提高效率：（1）优化转染条件。根据许多参数，可能需要尝试多种 siRNA 浓度和摇篮曲体积。实际上，一些细胞需要少量的 siRNA 才能非常有效地关闭基因，而另一些细胞则需要更多的 siRNA。因此，我们通常建议在 24 孔板中尝试使用 5 至 50 nM siRNA 和 1 至 4 µL Lullaby（体积必须根据板型进行调整）。这样，应该找到\"理想”量的siRNA和Lullaby。 (2) 等待 72H。根据许多参数（从 mRNA 翻译成靶标的蛋白质的半衰期、递送到细胞中的 siRNA 的浓度、细胞的免疫反应……），可能需要等到 72 小时才能观察沉默的效果. (3) 进行所谓的\"反向转染”：这意味着用 siRNA 转染细胞细胞解离时的接种时间。

我想测试用于共转染 siRNA 和质粒的 Lullaby siRNA 转染试剂。是否有可用的特殊方案？

为了进行共转染（siRNA 和 DNA），有两种技术：(1) 使用两种不同的试剂：Lullaby (siRNA)和 DreamFect Gold (DNA)。形成 (siRNA+Lullaby) 和 (DNA+DreamFect Gold) 的复合物，孵育 20 分钟后，混合两种溶液，然后将它们添加到细胞中。即使此方案之前对我们的一些合作者/客户有效，它也并不理想：某些细胞可能会同时转染这两种细胞，仅使用 siRNA 或仅使用 DNA。 (2) 仅使用 DreamFect Gold (DG)：DG 是一种非常强大的试剂，具有高压缩能力，可以轻松进行共转染。只需将 DNA 和 siRNA 混合在一起，然后将它们添加到 DG 溶液中离子。在孵育期间，复合物将与 (siRNA+DNA)+DG 形成。理论上，当质粒进入细胞时，siRNA 也会进入，因为它们在同一个复合体中。

您是否有关于转染携带三磷酸的 siRNA 的信息？

携带 siRNA 的三磷酸不干扰 siRNA 递送.相反，它们稳定 siRNA 并增加电荷，从而更好地与递送载体​​相互作用。我们通常对体外转录产生的 TPP-siRNA 唯一的建议是：转录后必须小心去除未结合的 TPP 残基，以避免转染细胞的 INF 反应（Dong-Ho Kim, Nature Biotechnology 22, 321 - 325 (2004) ).

摇篮曲研究 MDA-MB-231 等癌细胞系？

我们的试剂 Lullaby 与 MBA-MB-231 细胞配合得很好（请参考 Monteiro 等人，J. Cell. Biol.，2013 年和 Montagnacet 等人，Nature，2013 年）。通常，作者用 25 到 50 nM 的 siRNA 在低汇合度 (~20%) 转染细胞。

3D-TRANSFECTION 与在 3D 中培养细胞之前在 2D 中操作细胞相比，这样做有什么优势？

加载 3D 凝胶有很多优势在经典 2D 培养中使用复合物操作细胞。例如：(1) 细胞在更\"真实”的环境中转染：当细胞在 2D 中培养时，它们的行为（表型、代谢活动......）与在3D。因此，在基因沉默或基因表达方面，转染的反应在 3D 中会完全不同。此外，大多数在 2D 中起作用的商业试剂在 3D 中不起作用；这意味着细胞 are 在凝胶或支架上培养时处于不同状态。(2) 如果细胞在 2D 中培养，它们需要转染，并在基因表达或基因沉默出现之前进入细胞板 24 至 96 小时。然后，用胰蛋白酶处理分离细胞、洗涤、计数并加载到凝胶中。大量操作可能会影响实验，观察到的结果可能无法反映沉默或表达的真实情况。(3) 对于体内实验：有时需要仅注射凝胶或装有复合物的支架以进行测量侵袭、血管生成、骨形成、伤口愈合……（4）细胞特异性：有些细胞很难转染。例如神经干细胞，当在神经球中培养时，真的很难被转染。使用载有复合物的支架可以在神经球状态下转染它们。

3D-Fect 和 3D-FectIN 有什么区别？

这些试剂的目的是与核酸形成复合物，一旦形成复合物，它们就会加载到 3D 上矩阵。由于可用的 3D 支持物种类繁多，我们开发了 2 种试剂：3D-Fect 专为 3D 支架设计。我们所说的 3D 支架是指为细胞生长提供坚实支持的各种 3D 基质。该试剂适用于从\"经典”天然胶原蛋白支架到合成培养插入物。该试剂允许与核酸形成复合物，并与 3D 表面相互作用以用预形成的复合物覆盖它。一旦细胞定殖在基质上，它们就会与复合物接触，并且在它们生长的同时传递遗传物质。通过这种方式，细胞直接转染到 3D 支架上。3D-FectIN 专为 Matrigel 等 3D 水凝胶而设计。作用机制和3D-Fect类似，只是区别而已与凝胶配合使用效果更好的合成物。

3D-Fect 和 3D-FectIN 可以用于 mRNA 转染（不是 siRNA）吗？

3D-Fect 和 3D-FectIN 肯定可以用于 mRNA 转染；这些方案与 DNA 相同：您必须使用与方案推荐的 DNA 量相同的 mRNA 量以及相同的 3D-Fect 或 3D-FectIN 比率和体积。

DNA 转染提示 单元格

不要使用刚解冻的细胞。解冻后和转染前，至少传代细胞 3 次，以便它们有时间恢复并恢复正常行为。在细胞处于对数生长期和达到汇合之前传代细胞。当天将细胞铺板转染前以达到 60-80% 的视觉控制转染当天的流畅性。细胞应该健康且分裂活跃，它们不应在培养物中放置太久（> 8 周）。可以使用 OZ Biosciences 的 MTT 试剂盒 (#MT01000) 评估细胞活力，并可以使用 OZ Biosciences 的衰老试剂盒 (#GXS003) 检查衰老。细胞和培养基必须没有污染（支原体、酵母、细菌）。细胞应该是保持最佳培养条件。

DNA

DNA 溶液必须在不含 DNase/RNase 的水或 TE 缓冲液中制备。DNA 必须尽可能纯净，不含污染物（蛋白质、脂质、碳水化合物）和DNA 溶液的内毒素.Abs 260/280nm 应在1.7 和1.9 之间。请勿使用较低或较高比例的 DNA 溶液进行转染。确保您的启动子与待转染的细胞相容。

Controls

强烈建议您在转染实验中使用阳性对照。OZ Biosciences 提供大量编码最常见报告基因（GFP、b-Gal、荧光素酶、SEAP、CAT）的一系列 pVectOZ 控制质粒。模拟转染：在没有任何 DNA 的情况下进行转染控制，以便可以观察到转染试剂引起的最终非特异性效应.

转染实践我们建议在不添加任何添加剂的情况下在 DMEM 或 PBS 中制备 DNA/试剂复合物。在开始实验前让试剂达到室温。将 DNA 添加到转染试剂后，孵育在室温下静置 20 分钟以形成最佳复合物，然后将混合物直接添加到您的细胞中。一旦 DNA/试剂加入，不要等待超过 30 分钟形成复合物。将复合物以逐滴方式分配到细胞上，并轻轻摇动板以确保均匀分散。siRNA 转染技巧 细胞

不要使用刚解冻的细胞。解冻后和转染前，至少传代细胞 3 次，以便它们有时间恢复并恢复正常行为。在细胞处于对数生长期和达到汇合之前传代细胞。当天将细胞铺板转染前，以便在转染当天达到 60-80% 的视觉汇合。细胞应该健康且分裂活跃，培养时间不应过长（> 8 周）。可使用 OZ Biosciences 的 MTT 试剂盒 (#MT01000) 评估细胞活力，并可使用 OZ Biosciences 的衰老试剂盒 (#GXS003) 检查衰老。细胞和培养基必须无污染（mycoplasma、酵母、细菌）。细胞应保持在最佳培养条件下。

siRNA

使用不含 RNase 的材料。使用高质量的 siRNA（PAGE 纯化和脱盐）。如果可能，使用低 siRNA浓度（1-10nM）以避免脱靶和/或细胞毒性作用。不要用水稀释您的 siRNA 储备溶液，更喜欢制造商的缓冲液或 50mM Tris (pH 7.5) 中的 100mM NaCl 以避免变性。计算siRNA 的正确量：平均 siRNA 分子的分子量约为13.500.

控件阳性对照：使用针对管家基因（即 GAPDH）的 siRNA 或标记的 siRNA。阴性对照：使用错配和/或非靶向序列作为阴性对照。 转染实践

我们建议在 DMEM 或 PBS 中制备 siRNA/试剂复合物，无需任何补充剂。让试剂达到室温。将 siRNA 添加到转染试剂后，在室温下孵育 20 分钟以形成最佳复合物，然后直接将 mis 添加到您的细胞中。一旦形成复合物，等待时间不要超过 30 分钟。将复合物以逐滴方式分配到细胞上，并轻轻摇动板以确保均匀分散。siRNA 转染后的最佳沉默可在 24 小时后用于 mRNA 表达测定至 72 小时用于蛋白质表达测定。